Разрушаване на оралната бариера（3）

Откриването, оптимизирането и последващата модификация на PN-235 (икотрокинра, JN-2113)

Предимствата на перорално прилаганите циклични пептиди са описани подробно в предишни статии, като PN-235 получава значително внимание като едно от много малкото циклични пептидни лекарства, налични в момента за орално приложение. На 21 юли 2025 г. Protagonist и Janssen обявиха, че са подали заявление за ново лекарство (NDA) до FDA за Icotrokinra за лечение на умерен до тежък плакатен псориазис при възрастни и деца на 12 и повече години. Ако бъде одобрен, Icotrokinra се очаква да стане първото в света лекарство за перорално приложение, насочено към IL-23R за лечение на псориазис. Тази статия се фокусира върху процеса на откриване и системните стратегии за оптимизиране на тази молекула, като използва датите на публикуване на патенти като времева линия и също така обобщава потенциалните насоки за по-нататъшна оптимизация.

Още през 2007 г. Valorisation Hsj, Societe En Commandite подава заявка за патент за IL-23R пептидни антагонисти (WO2009007849). Това е един от най-ранните патенти, включващи IL-23R пептидни антагонисти в публично достъпната информация. Този патент описва серия от пептиди, насочени към IL-23R, включително агониста APG-2301 и антагонистите APG-2303, APG-2305, APG-2307 и APG-2309 (последователностите са показани на фигурата по-долу). Екипът използва аминокиселинната последователност на IL-23R като основа, комбинирана с техники за компютърно моделиране, за генериране на линейни пептиди, съответстващи на шарнирната му област (имитирайки IL-23 и действайки като IL-23R антагонисти). Сред тях APG-2305 и APG-2309 ефективно инхибират фосфорилирането на STAT3 в миши спленоцити in vitro, с IC50 стойности от 1 nM и 2 nM, съответно. Освен това, при модел на IBD на плъх, лечението с APG-2309 значително облекчава предизвикания от възпаление оток и зачервяване и значително намалява левкоцитната инфилтрация на лигавицата и съдовата конгестия, демонстрирайки добър противовъзпалителен и терапевтичен потенциал.

През 2013 г. Medical Diagnostic Laboratories (MDL) публикува патент (US20130029907), описващ откриването на IL-23R-свързващи пептиди с помощта на технология за фагов дисплей, като успешно идентифицира няколко пептидни последователности, които се свързват специфично с IL-23R. Това изследване конструира M13 фагова дисплейна библиотека, съдържаща произволни 12-mer пептидни последователности и извършва множество кръгове на скрининг, използвайки разтворим рекомбинантен IL-23R с пълна дължина и неговите варианти на снаждане като мишени. В крайна сметка бяха идентифицирани 27 пептида със свързваща активност. По-специално, тези пептидни последователности показват слабо сходство с кристалната структура на IL-23, докладвана от Beyer et al. (PDB ID: 3D85). Чрез подравняване на последователности изследователите откриха, че 66,7% от пептидите съдържат запазена последователност на разпознаване: -WX1X2X3W-, за която се предполага, че е ключов функционален мотив за свързване с IL-23R и блокиране на неговата низходяща сигнална трансдукция (представителна последователност е показана на фигурата по-долу). Впоследствие изследователите оцениха инхибиторната активност на пептидите върху свързването на IL-23 с IL-23R, използвайки конкурентни експерименти ELISA, идентифицирайки пептид 23 (12-мерен пептид) като най-активния пептид, който значително инхибира свързването на IL-23 към IL-23R (IC50=0.85 µM).

Въз основа на това екипът оптимизира структурата на пептид 23, включително удължаване или скъсяване на C/N краищата, замяна на вътрешни аминокиселини с киселинни/неутрални/основни аминокиселини и модификации на циклизиране. Резултатите от конкурентния ELISA показват, че удължаването на аминокиселините в двата края на пептид 23 има малък ефект върху неговата инхибиторна активност, но скъсяването води до намаляване на инхибиторната активност. Модифицирането на зарядните свойства на "X" остатъците в основния мотив -WX1X2X3W- (напр. замяна на отрицателно заредени остатъци с други отрицателно заредени, полярно незаредени или положително заредени остатъци) не повлиява значително неговата инхибиторна активност, което показва, че характеристиките на заряда на остатъците в този регион не са ключови детерминанти на активността на свързване. Замяната на един от остатъците на триптофан (W) в основната структура с фенилаланин (F) или тирозин (Y) запазва неговата инхибиторна способност, докато заместването му с аланин (A) намалява активността, което е в съответствие с характеристиките на последователността, получени от предишен скрининг на фагов дисплей.

Освен това, съкращаването на пептид 23.15 при запазване на основната -WQDYW- структура, въпреки че основният мотив беше запазен, значително отслаби неговата инхибиторна активност. В допълнение, въвеждането на цистеин (Cys) в двата края за образуване на цикличен пептид води до активност, сравнима с линейния пептид; въпреки това, намаляването на размера на цикличния пептид до 7 или 9 пептида при запазване на основната структура значително отслабва неговата способност да инхибира IL-23R.

В два последващи патента, публикувани от MDL (US20130172272 и US20160039878), изследователите са използвали основната структура -WX1X2X3W- като скеле и са конструирали и скринирали целева пептидна библиотека, използвайки технология за показване на рибозоми (последователност на пептидна библиотека: XXXWXXYWXXXX). След осем кръга на скрининг пептидите бяха допълнително подразделени въз основа на структурата -WX1X2YW-: Група A съдържаше -WVDYW-, Група B съдържаше -WQDYW-, а Група C съдържаше пептиди с други основни последователности. Тестовете за активност ELISA показаха, че пептид №. 2/7 в група А има по-добра активност в сравнение с пептид №. 23.19, разкрит в предишния патент. При конкурентни ELISA тестове пептид №. 7 има IC50 от 58,0 nM, а пептид №. 2 има IC50 от 34,6 nM.

Впоследствие, използвайки пептид NO.2 и пептид NO.7 като отправни точки, бяха проектирани и синтезирани три циклични пептида: 2HT-AA, 7-CC и 7HT-AA. Сред тях молекулата 2HT-AA, базирана на циклизацията от глава-към-опашка на аланиновите остатъци в двата края на пептид NO.2, показва най-добра активност (структура е показана на фигурата по-долу), с конкурентна ELISA IC50 от 8,1 nM и репортерна активност от 341,8 nM (метод на тестване: IL-23 стимулира DB клетъчна линия, трансфектирана със STAT3 репортерен ген, и инхибиторната активност се определя количествено чрез откриване на експресия на репортерен ген). Това представлява 4-6-кратно увеличение на активността в сравнение с линейния пептид. При in vitro тестове за активност, 2HT-AA ефективно инхибира IL-23-индуцираната секреция на IL-17F в човешки Th17 клетки по зависим от концентрацията начин и блокира производството на IL-22 в човешки РВМС и спленоцити на плъх. Едновременно с това, този цикличен пептид също понижава нивата на IL-17F иРНК в спленоцитите на плъхове. За съжаление, въпреки обещаващата фармакологична активност на 2HT-AA, не са намерени последващи доклади за оптимизиране на тази циклична пептидна структура и нейните производни от MDL.